为解决实际临床应用中骨植入体表面 “骨整合质量差”和“缺少抗菌性”两大关键问题,课题组利用离子注入、微弧氧化和水热处理等多种技术调控医用钛表面结构组成及化学成分,赋予其对细胞细菌的选择性响应功能;并探究表面对细胞细菌选择性生物学效应作用机制,为解决骨组织植入体临床应用中骨整合质量差及术后细菌感染普遍的问题提供细胞及分子层面的理论依据

1.钛表面抗菌改性层构建及其抗菌机制研究 

1.1 基于“微电池效应”选择性抗菌 

纳米银因其抗菌效果显著且不易“耐药”而备受关注,但纳米银不具有“识别”细菌和细胞的能力,“游离态”纳米银有可能进入细胞内部,引起严重细胞毒性反应。因此,采用纳米银改善钛合金的抗菌性必需首先调控其生物学行为,使其能够“区别对待”细菌和细胞。鉴于此,课题组采用单元等离子体浸没银离子注入在纯钛表面原位构建了镶嵌式的纳米银颗粒,纳米银由于被固定在钛表面,在生物环境中不易大量释放,有效克服了“游离态”纳米银易进入细胞引起毒性的缺点。体内外实验结果表明:镶嵌纳米银的钛表面不但接触抗菌性良好,而且细胞相容性优异。钛表面镶嵌纳米银的上述选择性抗菌生物学行为被认为是由于纳米银与钛基体协同的“微电池效应”所致(图1)。该工作结果详见Biomaterials, 2011, 32(3): 693-705; Biomaterials, 2014, 35(33): 9114-9125; ACS Appl. Mater. Interfaces 2017, 9, 5149-5157。 

1. 镶嵌银纳米颗粒的钛表面与细菌相互作用的可能机制 [ Biomaterials, 2011, 32(3): 693-705] 

  

1.2纳米银/氧化钛复合涂层肖特基接触选择性抗菌 

利用等离子体浸没离子注入技术在氧化钛表面制备镶嵌式纳米银,提出利用纳米银/氧化钛基于“肖特基接触”的协同界面效应(图2),可将来自细菌的电子聚集到纳米银表面,从而在氧化钛涂层表面镜像地产生空位聚集,并进一步激活氧化反应,以抑制细菌粘附;此外,由于细胞表面不存在类似细菌表面的电子传导链,即不会在纳米银表面大量聚集电子而引起氧化反应,故这种界面结构不会对细胞粘附产生负面影响。同时,我们发现,纳米银与氧化钛的协同抗菌效应不但与纳米银颗粒的尺寸相关,还与纳米银之间的距离有关(图2),纳米银颗粒间距过小,纳米银聚集电子的能力会减弱,对抑制细菌粘附不利。同时发现纳米银/五氧化二钽(Mater. Lett., 2016, 179: 1-4)、 纳米金/氧化钛 (Appl. Phys. Lett., 2014, 104(26): 261110)和纳米铁/氧化钛体系(Acta biomater., 2014, 10(10): 4505-4517)也具有类似抗菌行为。上述这类界面结构具有“选择性生物响应”的特点,并且这种效应受“肖特基接触”相关理论调节。该工作相关结果详见Acta Biomater., 2013, 9:5100-5110; J. Phys. Chem. Lett. 2014, 5, 743-748. 

 

2. 纳米银/氧化钛复合涂层肖特基接触抗感染及其间距效应[Acta biomater., 2014, 10(10): 4505-4517; J. Phys. Chem. Lett. 2014, 5, 743-748] 

  

1.3基于功能元素掺杂制备抗菌薄膜/涂层 

 随着细菌耐药性问题日益凸显,采用无机抗菌剂杀菌是目前的研究重点。该部分研究利用水热反应、微弧氧化、离子注入等技术在钛表面构建含Cu、Zn、Mn和Fe等微量元素的涂层/薄膜,赋予钛表面抗菌功能。采用微弧氧化和水热法,可在钛表面制备铜掺杂的氧化钛涂层(图3),释放的铜离子可破坏大肠杆菌的细胞膜,从而产生良好的抗菌效果(J. Mater. Chem. B, 2014, 2(39): 6738-6748)。采用离子注入技术可将铜注入到钛表面,随着铜离子的缓慢释放可明显改善钛表面的抗菌性能(J. Mater. Chem. B, 2016, 4(7): 1296-1309) 。利用离子注入技术也可将锌注入到钛表面,缓慢释放的锌离子可通过抑制细菌的呼吸电子传递链,进而抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长,其抗菌效果与注入电压与时间有关(Colloid. Surface. B, 2014, 117: 158-165; Surf. Coat. Tech., 2017, 312: 75-80)。通过向微弧氧化电解液中加入高锰酸钾溶液,可在钛表面制备具有优良抗菌性能的锰掺杂氧化钛涂层。高锰酸钾作为强氧化物,能够提高氧化层的稳定性,使得涂层中的锰离子能够以较平稳的速率长期缓慢释放,以维持涂层的抗菌性能(J. Mater. Chem. B, 2014, 2(33): 5397-5408.)。采用锰离子注入可在钛表面形成Mn2O3,进而产生催化作用生成活性自由基,产生一定的抗菌效果(Colloid. Surface. B, 2017, 152: 376-384)。利用铁离子注入可得到具有众多表面活性位点的含单质铁、铁氧化物的改性层。通过释放亚铁离子,导致培养溶液中产生活性氧自由基(ROS)实现抗菌(RSC Adv., 2016, 6(52): 46495-46507.)。 

3. 含铜氧化钛涂层的抗菌及成骨效果[J. Mater. Chem. B, 2014, 2(39): 6738-6748] 

  

2 具有成骨功能的钛表面构建 

2.1表面化学成分对成骨性能影响 

钛及其合金是生物惰性材料,骨整合能力差,当植入物植入人体时容易被纤维组织包裹,最终可能导致临床上的失败。表面化学成分改性能有效地促进钛及钛合金的生物活性及生物相容性,因此受到了广泛的关注。 

Zn被认为是人体生命活动的一种重要微量元素,与300多种蛋白质的功能或结构相关,并参与了大量的细胞过程,如DNA合成、酶活性和细胞分裂。为探究锌元素对干细胞成骨分化的影响规律,我们采用阳极氧化和水热处理的方法在钛表面构建了锌掺杂的二氧化钛纳米管。结果发现,合适的纳米管尺寸及锌离子释放,能促进骨髓间充质干细胞的成骨分化,这与ERK1/2信号通路活化有关(Biomaterials 2013, 34, 3467-3478)。进一步的研究表明,离子注入锌的PEO涂层具有较高的碱性磷酸酶活性并促进成骨相关基因(OCN, Col-I, ALP, Runx2)的表达(Biomaterials 2014, 35, 6882-6897)。 

 

4. 钛表面含锌涂层的构建示意图[Biomaterials 2014, 35,6882-6897] 

Ag纳米颗粒具有优异的抗菌性能,因而被广泛应用于生物医学领域。另外,有研究表明,Ag纳米颗粒在一定的情况下能够促进干细胞的成骨分化。为此,我们采用等离子体浸没离子注入(PIII)技术在钛表面注入Ag纳米颗粒,探究了镶嵌Ag纳米颗粒对成骨分化的影响规律。结果表明钛表面镶嵌Ag纳米颗粒能够激活BMSCs中整合素α5协调的成骨细胞分化相关的MAPK / ERK信号级联并促进钛的骨整合(ACS Appl. Mater. Interfaces 2017, 9, 5149-5157)。 

5. Ag NPs催化整合素α5β1的活化,促进大鼠骨髓干细胞(BMSCs)的骨向分化[ACS Appl. Mater. Interfaces 2017, 9, 5149-5157] 

  

此外,很多微量元素,如Sr、Mn、Cu和Fe等也具有一些特定的生物学性能。通过微弧氧化、碱热处理和离子交换技术,成功地在纯钛表面制备了含Sr的微纳结构涂层,该涂层能显著增强骨髓间充质干细胞的粘附、铺展和成骨分化(J. Mater. Chem. B, 2015,3, 4790-4804);利用微弧氧化技术制备含Mn的改性层,其表现出很强的抗腐蚀性,并能够促进胶原分泌及细胞外基质矿化,表现出较好的促成骨分化能力(J. Mater. Chem. B, 2014, 2,5397-5408)。相似地,离子注入Mn涂层也可以促进胶原分泌及成骨相关基因的表达(Colloid. Surface. B 2017, 152, 376–384 );离子注入Fe的二氧化钛涂层能显著增强MC3T3-E1细胞的增殖,促进细胞产生更多的丝状伪足和板状伪足,有利于细胞的粘附(Acta Biomater. 2014,10, 4505-4517);进一步的研究表明,纯钛表面离子注入铁,能促进MC3T3-E1和rBMSC的粘附、增殖和成骨分化(RSC Adv., 2016, 6, 46495-46507);钛表面离子注入Cu的结果表明,低含量Cu的样品能促进rBMMSC细胞增殖,并促进成骨相关基因及成血管相关基因的表达(J. Mater. Chem. B, 2016, 4, 1296-1309)。 

  

2.2 表面微/纳形貌对成骨性能的影响 

通过酸碱处理,在纯钛表面制备了多级微/纳米钛酸盐薄膜,结果表明,多级化的微/纳米钛酸盐薄膜可显著减少细菌附着和胆管癌细胞增殖,促进大鼠骨髓间充质干细胞粘附、骨生成和血管生成(J. Colloid. Interface Sci., 2014, 436, 160-170)。采用热氧化处理法,在钛表面构建了微纳米坑结构,随着处理时间的延长,氧化层厚度增加,坑洞中出现的氧化物颗粒的粒径增加,因而提高了材料的亲水性。该结构可促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨活性,提高了体内的骨整合能力(Sci. Rep., 2016, 6, 31769)。采用微弧氧化和电化学处理法(图6),在钛表面构建了微/纳结构,研究发现该微/纳结构可通过调节β1信号通路显著促进犬类骨髓间充质干细胞的粘附和成骨分化。(ACS Appl. Mater. Interfaces, 2016, 8, 3840-3852)。 

6. 微弧氧化处理(a);电化学处理(b) [ACS Applied Materials & Interfaces, 2016, 8, 3840-3852] 

采用草酸和过氧化氢热处理法在钛表面可控制备了两种锯齿状纳米结构,并对两种纳米锯齿状结构对大鼠骨髓间质干细胞的成骨分化性能进行了评估。结果表明,随着热处理时间的增加,锯齿间距和材料表面亲水性增加,因而表现出更好的促细胞粘附和促成骨性能(Int. J. Nanomed., 2012, 7, 4459-4472)。 

 

7. 经不同工艺处理后样品表面形貌:钛(左);过氧化氢处理6 h(中);过氧化氢处理24 h(右)[Int. J. Nanomed., 2012, 7, 4459-4472] 

在上述工作的基础上,将过氧化氢热处理的时间增加到72小时,在钛表面形成微/纳米棒结构,该结构增加了细胞和基质之间接触点的数量,促进了细胞粘附和成骨分化(Int. J. Nanomed., 2013, 8, 257-265)。 

 

8. 经不同工艺处理后样品表面形貌:草酸处理钛(上);草酸处理和过氧化氢处理72h(下)[Int. J. Nanomed., 2013, 8, 257-265] 

  

3 兼具抗菌和成骨性能钛表面构建 

兼具抗菌和成骨性能是种植牙和人工关节等骨植入体的发展方向。结合微弧氧化和水热处理工艺制备得到的铜掺杂二氧化钛涂层具有良好的抗菌能力、成骨和成血管性能(J. Mater. Chem. B, 2014, 2, 6738-6748)。锌和银二元离子共注入的钛表面可形成Zn/Ag电偶腐蚀对,通过电偶腐蚀效应赋予钛表面良好的抗菌和成骨性能 (Biomaterials, 2014, 35, 7699-7713)。锌和银二元离子共注入和不同顺序注入的钛表面可形成三种不同类型的电偶腐蚀对,注入顺序对电偶腐蚀速率产生显著影响,腐蚀速率高的Zn/Ag共注入样品表面具有更好的抗菌和成骨性能 (Biomaterials, 2015, 65, 22-31 )。镁和银二元离子共注入形成的Mg/Ag电偶腐蚀对可促进镁离子的释放,并抑制银离子的释放,赋予钛表面良好的抗菌和成骨性能 (ACS Appl. Mater. Interfaces, 2015, 7, 17826?17836)。通过锌和镁二元离子共注入技术可在钛表面构建具有良好的骨诱导性、促成血管和抗菌能力的改性层 (Acta Biomater., 2017, 49, 590-603)。将银和钙同时注入钛表面构建“双功能微电池”,“微电池”的阴极析氢反应和阳极腐蚀反应的协同作用使细菌处于严重“应激”状态,同时可促进骨整合(Mater. Horiz., 2018, 5, 264-267)。 

9. “双功能微电池效应抗菌思路示意图[Mater. Horiz., 2018, 5, 264-267]  

  

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