工程细胞和使用方法与流程

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年2月2日提交的美国临时专利申请序列第62/453922号和2017年10月30日提交的美国临时专利申请序列第62/578721号的优先权权益,其全部内容通过引用并入本文。

政府权利

本发明部分地在美国国立卫生研究院(nih)授予的授权号gm093282的政府支持下完成。美国政府拥有本发明的特定权利。

本公开涉及工程细胞和经修饰的细胞,特别是在医学领域。

背景技术:

本文中的所有出版物均以引用并入,其程度如同具体和单独地指出每个单独的出版物或专利申请通过引用并入。以下描述包括可用于理解本发明的信息。本文提供的任何信息均不承认为是现有技术或与当前要求保护的发明相关,或者具体或暗含地引用的任何出版物是现有技术。

癌症是美国和全世界的死亡的主要原因。最近,除了用于治疗癌症的手术、放射和化疗之外,免疫治疗已成为第四种武器。癌症免疫治疗旨在利用身体自身的免疫系统来对抗癌症。虽然已经在过继细胞治疗(act)和检查点阻断治疗方面取得了良好的效果,但输注到患者体内的t细胞的抗癌特性仍有待改善,包括其迁移潜力和抵抗肿瘤微环境中免疫抑制信号的能力。自然杀伤(nk)细胞在对抗恶性细胞的先天免疫中起关键作用,并且还被开发为癌症免疫治疗中有效的癌症杀手。然而,基于nk细胞的治疗的一个挑战是难以从患者的血液中获得足够数量的活性nk细胞。nk-92是从具有克隆性nk细胞淋巴瘤的患者建立的高细胞毒性自然杀伤(nk)细胞系,其可用于以gmp级产生更多数量的细胞毒性nk细胞。特异性靶向是良好癌症治疗的黄金标准。然而,nk-92细胞不表达靶向特定细胞的用于adcc作用的fc受体,这限制了它的广泛应用。

同样,树突状细胞(dc)长期以来一直被认为是癌症免疫治疗的核心参与者。dc的迁移能力对基于dc的免疫治疗的结果具有深远的影响。然而,显示只有一小部分(1%至2%)总施用的dc到达次级淋巴器官以活化t细胞,这限制了该疫苗接种方法的实际应用。

因此,本领域仍然需要能够有效地将抗原特异性抗体标记在细胞表面上,这反过来又引导这些细胞消灭患病细胞中的特异性抗原表达并有效地治疗疾病的新组合物和方法。

技术实现要素:

本文公开的各种实施方案包括工程细胞,其包含与细胞表面上存在的细胞表面聚糖共价结合的化学或生物部分,其中化学或生物部分选自小分子、多核苷酸、多肽和抗体。在一个实施方案中,工程细胞是免疫细胞。在一个实施方案中,工程细胞是t细胞或自然杀伤(nk)细胞。在一个实施方案中,t细胞是cd8+t细胞或cd4+t细胞。在一个实施方案中,细胞是树突状细胞(dc)。在一个实施方案中,小分子是小药物分子或其药学上可接受的盐或共晶体。在一个实施方案中,抗体是单链可变片段(scfv)、片段抗原结合(fab)片段或全长抗体。在一个实施方案中,抗体是免疫球蛋白g(igg)抗体。在一个实施方案中,igg是全长igg。在一个实施方案中,与工程细胞连接的化部分学或生物部分是生物标志物和/或探针。在一个实施方案中,化学部分或生物部分是生物素探针、荧光探针、生物正交反应柄(biorthogonalreactionhandle)和/或染料标记的单链dna。在一个实施方案中,染料是fam。在一个实施方案中,荧光探针是cy3。在一个实施方案中,生物正交反应柄是四嗪。在一个实施方案中,岩藻糖衍生物是gdp-岩藻糖。在一个实施方案中,工程细胞是嵌合抗原受体(car)-t细胞。在一个实施方案中,car-t细胞包含基因修饰的t细胞,其细胞表面glcnac与携带新基序的gdp-岩藻糖共价结合。在一个实施方案中,car包含三个结构域:scfv、fab和/或与同源受体结合的成熟配体。在一个实施方案中,细胞表面聚糖是n-乙酰葡糖胺(glcnac)。在一个实施方案中,化学部分或生物部分通过岩藻糖衍生物与glcnac共价结合。在一个实施方案中,细胞表面聚糖是唾液酸(neuac)。

本文公开的各种实施方案还包括组合物,其包含:抗体-细胞缀合物,其中一种或多于一种抗体与细胞表面上的一个或多于一个聚糖部分共价结合。在一个实施方案中,细胞是免疫细胞。在一个实施方案中,细胞是原代人t细胞、自然杀伤(nk)细胞、cd4+细胞和/或原代cd8+ot-1t细胞。在一个实施方案中,nk细胞是nk-92mi细胞。在一个实施方案中,细胞是树突状细胞(dc)。在一个实施方案中,抗体是曲妥珠单抗。在一个实施方案中,细胞是nk-92mi,并且至少一种抗体是曲妥珠单抗。在一个实施方案中,多于一种类型的抗体缀合在细胞表面上。在一个实施方案中,聚糖部分是n-乙酰葡糖胺(glcnac)。在一个实施方案中,抗体通过岩藻糖衍生物与glcnac共价结合。在一个实施方案中,聚糖部分是唾液酸(neuac)。在一个实施方案中,组合物是药物组合物。在一个实施方案中,药物组合物还包含药学上可接受的载体或赋形剂。在一个实施方案中,药物组合物用于治疗对象的疾病。在一个实施方案中,抗体-细胞缀合物能够牢固地结合在炎症位点上(抗e-选择素)、靶向特异性癌细胞(抗her2)、和/或阻断免疫检查点(抗pd-l1)。

本文公开的各种实施方案还包括治疗对象的疾病的方法,其包括:提供包含工程细胞和药学上可接受的载体的药物组合物;和通过向对象施用治疗有效剂量的药物组合物来治疗疾病,其中工程细胞包含与其表面上存在的聚糖部分共价结合的化学部分或生物部分,并且其中化学部分或生物部分选自小分子、多核苷酸、多肽和抗体。在一个实施方案中,抗体是免疫球蛋白g(igg)抗体。在一个实施方案中,抗体是抗pd-l1抗体。在一个实施方案中,抗体是抗e-选择素抗体。在一个实施方案中,抗体是抗her2抗体。在一个实施方案中,抗体是曲妥珠单抗。在一个实施方案中,多于一种化学部分或生物部分与细胞表面共价结合以同时靶向多于一种疾病。在一个实施方案中,细胞是树突状细胞。在一个实施方案中,细胞是免疫细胞。在一个实施方案中,细胞是原代人t细胞、自然杀伤(nk)细胞、cd4+细胞和/或原代cd8+ot-1t细胞。在一个实施方案中,nk细胞是nk-92mi细胞。在一个实施方案中,聚糖部分是n-乙酰葡糖胺(glcnac)。在一个实施方案中,化学部分或生物部分通过岩藻糖衍生物与glcnac共价结合。在一个实施方案中,岩藻糖衍生物包含岩藻糖-炔烃。在一个实施方案中,聚糖部分是唾液酸(neuac)。在一个实施方案中,疾病是癌症。在一个实施方案中,治疗疾病包括减少对象的癌性肿瘤的大小。在一个实施方案中,癌症是乳腺癌。

本公开的实施方案还包括治疗、减少、抑制或减轻对象的癌症的方法,其包括:向对象施用治疗有效剂量的药物组合物,所述药物组合物包含工程细胞,该工程细胞具有与其表面上的聚糖部分共价结合的抗体。在一个实施方案中,癌症是乳腺癌。在一个实施方案中,抗体是曲妥珠单抗。在一个实施方案中,细胞是nk-92mi。在一个实施方案中,多于一种抗体缀合在细胞表面上以同时靶向多于一种癌症。

本公开的实施方案还包括制备工程细胞的方法,其包括:制备包含与岩藻糖或gdp-岩藻糖共价结合的化学部分或生物部分的岩藻糖衍生物或gdp-岩藻糖衍生物;通过将细胞与包含(a)岩藻糖衍生物和/或gdp-岩藻糖衍生物和(b)岩藻糖基转移酶的组合物一起孵育来制备工程细胞。在另一个实施方案中,本文公开了制备工程细胞的方法,其包括:通过使携带tco部分的抗体与cs-az-tz或cs-poc-tz反应来生成与抗体缀合的cmp-唾液酸(cs-igg);和通过将天然存在的细胞与包含(a)cs-igg和(b)唾液酸转移酶的组合物一起孵育来制备工程细胞。在一个实施方案中,岩藻糖基转移酶是α-1,3-岩藻糖基转移酶。在一个实施方案中,α-1,3-岩藻糖基转移酶是幽门螺杆菌(h.pylori)α-1,3-岩藻糖基转移酶。在一个实施方案中,重组制备α-1,3-岩藻糖基转移酶。在一个实施方案中,唾液酸转移酶选自st6gal1、多杀巴斯德氏菌(pasteurellamultocida)α(2,3)唾液酸转移酶m144d突变体(pm2,3st-m144d)和美人鱼发光杆菌(photobacteriumdamsel)α(2,6)唾液酸转移酶(pd2,6st)。在一个实施方案中,化学部分或生物部分选自小药物分子、生物分子、探针分子、荧光团、多核苷酸、多肽和完整igg、或其组合。在一个实施方案中,生物分子是曲妥珠单抗。在一个实施方案中,细胞是免疫细胞。在一个实施方案中,细胞是原代人t细胞或自然杀伤(nk)细胞。在一个实施方案中,nk细胞是nk-92mi细胞。在一个实施方案中,t细胞是cd4+细胞或cd8+t细胞。在一个实施方案中,化学部分或生物部分通过岩藻糖衍生物与细胞表面上的n-聚糖通用单元lacnac共价连接。在一个实施方案中,岩藻糖修饰的生物分子和/或gdp-岩藻糖修饰的生物分子包括岩藻糖-炔烃和/或gdp-岩藻糖叠氮化物。在一个实施方案中,使用配体加速和生物相容的铜(i)催化的炔烃-叠氮化物环加成(cuaac)反应,用化学部分或生物部分进一步修饰生物分子-细胞缀合物。

本文公开的各种实施方案还包括制备适于将分子连接在工程细胞表面上的工程细胞的一锅法,其包括:通过将岩藻糖类似物与包含atp、gtp、l-岩藻糖激酶/gdp-岩藻糖焦磷酸化酶(fkp)、mg2+或mn2+、和无机焦磷酸酶(pp酶)的混合物组合来制备gdp-岩藻糖类似物;和通过将天然存在的细胞添加到包含来自步骤(a)的粗产物和幽门螺杆菌α-1,3-岩藻糖基转移酶的组合物中来制备工程细胞。在一个实施方案中,本文公开了制备适于将分子连接在工程细胞表面上的工程细胞的一锅一步法,其包括:将细胞与包含岩藻糖类似物、atp、gtp、l-岩藻糖激酶/gdp-岩藻糖焦磷酸化酶(fkp)、mg2+或mn2+、无机焦磷酸酶(pp酶)和幽门螺杆菌α-1,3-岩藻糖基转移酶的组合物一起孵育。在一个实施方案中,岩藻糖类似物包含与化学部分或生物部分缀合的岩藻糖。在一个实施方案中,岩藻糖类似物包含岩藻糖-炔烃。在一个实施方案中,工程细胞包含与细胞表面上的聚糖连接的化学部分或生物部分。在一个实施方案中,来自步骤(a)的产物通过铜催化的叠氮化物-炔烃环加成(cuacc)反应被进一步修饰,以产生与小分子、多核苷酸、多肽和/或抗体缀合的gdp-岩藻糖类似物。

本公开的其他实施方案包括将细胞表面lacnac或slacnac转化为lex或slex的一锅原位岩藻糖基化策略,其包括:通过将岩藻糖类似物与包含atp、gtp、fkp、mg2+或mn2+和无机焦磷酸酶(pp酶)的混合物组合来制备gdp-岩藻糖类似物;和通过将天然存在的细胞加入到包含来自步骤(a)的粗产物和幽门螺杆菌α-1,3-岩藻糖基转移酶的组合物中,将细胞表面lacnac或slacnac转化为lex或slex。

本文公开的各种实施方案还包括试剂盒,其包含:gdp-岩藻糖衍生物和幽门螺杆菌α-1,3-岩藻糖基转移酶。

通过以下结合附图的详细描述,本发明的其他特征和优点将变得明显,附图通过举例的方式示出了本发明的各种实施方案。

附图说明

示例性实施方案在参考图中示出。本文公开的实施方案和附图旨在被认为是说明性的而非限制性的。

图1描绘了根据本文的实施方案,原位一锅法岩藻糖基化试剂制备和细胞表面反应方案。

图2描绘了根据本文的实施方案,使用粗制一锅法gdp-岩藻糖对培养的中国仓鼠卵巢(cho)细胞进行原位一锅岩藻糖基化。

图3描绘了根据本文的实施方案,使用粗制的一锅法gdp-岩藻糖-生物素修饰培养的lec2cho细胞表面。

图4描绘了根据本文的实施方案,使用粗制的一锅法gdp-岩藻糖-cy3修饰培养的lec2cho细胞表面。

图5描绘了根据本文的实施方案,使用粗制的一锅法gdp-岩藻糖-四嗪修饰培养的lec2cho细胞表面。

图6描绘了根据本文的实施方案,使用粗制的一锅法gdp-岩藻糖-bsa修饰培养的lec2cho细胞表面。

图7描绘了根据本文的实施方案,使用粗制的一锅法gdp-岩藻糖-抗体修饰培养的lec2cho细胞表面。

图8描绘了根据本文的实施方案,使用粗制一锅法gdp-岩藻糖-tz和随后的tco-抗体修饰培养的lec2cho细胞表面。

图9描绘了根据本文的实施方案,使用粗制的一锅法gdp-岩藻糖-生物素修饰培养的野生型cho细胞表面。

图10描绘了根据本文的实施方案,使用粗制的一锅法gdp-岩藻糖-生物素修饰活化的小鼠cd8+细胞表面。

图11描绘了根据本文的实施方案,使用粗制的一锅法gdp-岩藻糖-生物素修饰小鼠树突状细胞(dc)表面。

图12描绘了根据本文的实施方案,使用粗制的一锅法gdp-岩藻糖-生物素修饰初始或活化的人cd8+t细胞表面。

图13描绘了根据本文的实施方案,使用粗制的一锅法gdp-岩藻糖-tz修饰活化的小鼠cd8+t细胞表面,然后与tco-小鼠igg缀合。

图14描绘了根据本文的实施方案,使用粗制的一锅法gdp-岩藻糖-tz修饰活化的小鼠cd8+t细胞表面,然后与tco-小鼠igg和tco-大鼠igg一起缀合。

图15描绘了根据本文的实施方案,在ot-1t细胞表面上配置抗pd-l1抗体。

图16描绘了根据本文的实施方案,在ot-1t细胞表面上配置抗pd-l1抗体促进了过继细胞治疗(act)。

图17描绘了根据本文的实施方案,体内扩增的小鼠cd8+t细胞的原位一锅法岩藻糖基化增加了e-选择素结合并抑制了gal-1结合。

图18描绘了根据本文的实施方案,诱导的小鼠调节性t细胞(itreg)的原位一锅法岩藻糖基化增加了e-选择素结合。

图19描绘了根据本文的实施方案,人t细胞的原位一锅法岩藻糖基化增加了e-选择素结合。

图20描绘了根据本文的实施方案,人天然调节性t(ntreg)细胞的原位一锅法岩藻糖基化增加了e-选择素结合并抑制了gal-1结合。

图21描绘了根据本文的实施方案,her2特异性人car-t细胞的原位一锅法岩藻糖基化增加了e-选择素结合并抑制了gal-1结合。

图22描绘了根据本文的实施方案,体外分化的小鼠cd8t细胞的原位一锅法岩藻糖基化显著增强了e-选择素结合并降低了gal-1结合。

图23描绘了根据本文的实施方案,体外分化的小鼠ot-1cd8t细胞的原位一锅法岩藻糖基化对细胞表面标志物的表达几乎没有影响。

图24描绘了根据本文的实施方案,用体外分化的聚糖修饰的ot-1t细胞处理b16-ova包埋小鼠显著降低了肿瘤生长。

图25描绘了根据本文的实施方案,用体内分化的聚糖修饰的ot-1t细胞处理b16-ova包埋小鼠显著地降低了肿瘤生长并延长肿瘤包埋小鼠的寿命。

图26描绘了根据本文的实施方案,体外分化的小鼠树突状细胞(dc)的原位一锅法岩藻糖基化显著增强了e-选择素结合并降低了半乳凝素-1结合。

图27描绘了根据本文的实施方案,负载抗原的dc的岩藻糖基化诱导了显著更强的抗肿瘤免疫应答。

图28描绘了根据本文的实施方案,使用粗制的一锅法gdp-岩藻糖-dna-fam修饰培养的lec2cho细胞表面。

图29描绘了根据本文的实施方案,配置在培养的lec2cho细胞表面上的抗人e-选择素可以结合人e-选择素。

图30描绘了根据本文的实施方案,配置在培养的lec2cho细胞表面上的抗小鼠pd-l1可以结合小鼠pd-l1。

图31描绘了根据本文的实施方案,配置在培养的cho细胞表面上的抗小鼠ctla4可以结合小鼠ctla4蛋白。

图32描绘了根据本文的实施方案,配置在小鼠树突状细胞表面上的抗小鼠ctla4可以结合小鼠ctla4蛋白。

图33描绘了根据本文的实施方案,配置在ot-1cd8t细胞表面上的小鼠igg可以在表面上停留多于24小时。

图34描绘了根据本文的实施方案,ot-1cd8t细胞与小鼠igg抗体缀合不影响经修饰的细胞的增殖速率。

图35描绘了根据本文的实施方案,配置在ot-1cd8t细胞表面上的抗小鼠pd-l1可以在细胞表面上停留多于24小时。

图36描绘了根据本文的实施方案,ot-1cd8t细胞与抗pd-l1抗体缀合不影响经修饰的细胞的增殖速率。

图37描绘了根据本文的实施方案,配置在ot-1cd8t细胞表面上的抗小鼠pd-l1可以结合小鼠pd-l1。

图38描绘了根据本文的实施方案,配置在ot-1cd8t细胞表面上的抗小鼠pd-l1可以增强t细胞对癌细胞的杀伤功能。

图39描绘了根据本文的实施方案,基于一步法酶促岩藻糖基化的细胞表面工程策略。(a)两种常规使用的细胞表面工程方法。代谢工程用于将反应柄(x)配置到细胞表面上,它可以与目标分子上的互补柄(y)反应。基因工程强大且稳健,能够在细胞表面配置功能性分子和反应柄。这两种方法通常具有多个步骤,并持续数天。(b)酶促糖工程方法,其能够一步将多种功能性分子转移至细胞表面。通过来自幽门螺杆菌的α1,3fuct实现细胞表面lacnac/唾液酸lacnac和gdp-fuc衍生物之间的反应,使得可以在岩藻糖的c6位置处耐受与完整igg一样大的修饰。(c)描述了gf-al和gf-az衍生物的一锅合成方案。显示的功能性(z)包括生物正交柄(四嗪,tz)、生物物理探针(生物素,cy3)和生物材料(ssdna)。

图40描绘了根据本文的实施方案,igg向lec2cho细胞的细胞表面的酶促转移。(a)gdp-fuc修饰的igg(gf-igg)合成的示意图。显示了生物正交柄和接头的化学结构。(b)使用fuct将gf-igg转移至cholec2细胞表面的方案。(c)用酶ft、底物gf-rigg或两者处理的lec2细胞的流式细胞术分析。(d)在酶促转移中gf-rigg浓度(0.005mg/ml至0.2mg/ml)的滴定。每个反应使用相同量的ft并在室温下放置30分钟。平均值±sd(误差条),来自三个独立实验的代表性图。(e)gf-rigg在冰上酶促转移至lec2细胞的时间过程。在37℃下的反应是最大标记对照。(f)igg标记之前和之后lec2细胞活力的流式细胞术分析。(g)在酶促igg转移中将没有lacnac表达的cholec8细胞作为阴性对照与lec2细胞进行比较。平均值±sd(误差条),来自三个独立实验的代表性图。(h)当与alexafluor647标记的gf-rigg一起孵育时,使用或不使用ft处理的lec2细胞的共聚焦显微镜图像。细胞核用hoechst33342染色。比例尺:2μm。(i)同时用rigg和migg标记的lec2细胞的流式细胞术分析。

图41描绘了根据本文的实施方案,α-e-选择素酶促转移至原代人t细胞。(a)修饰的(1)和天然的(2)人t细胞在huvec细胞上结合和跨膜迁移过程的示意图。(b)ft介导的来自三个不同供体的原代人t细胞上的gf-α-he-sel标记。平均值±sd(误差条),来自三个独立实验的代表性图。(c)人e-选择素-fc嵌合体在未标记的t细胞和经migg或α-he-sel标记的t细胞上的结合。平均值±sd(误差条)。(d)在剪切应力条件下对人e-选择素-fc包被的载玻片的流动室测定分析。将用migg或α-he-sel标记的t细胞与未标记的t细胞进行比较。在imagej中定量细胞数(细胞/mm2)。平均值±sd(误差条)。(e、f)结合huvec的人t细胞的定量分析和荧光显微镜图像。用cfse(绿色)对人t细胞进行染色,用hoechst33342(蓝色)和did(红色)对huvec细胞进行染色。如果需要,用tnf-α预处理huvec。平均值±sd(误差条),来自三个独立实验的代表性图。比例尺:50μm。(g)huvec的跨膜迁移测定分析。通过荧光信号定量底层中迁移的t细胞(leukotracker,绿色)。在所有图中:ns,p>0.05;*p95%是人t细胞)。在第0天(初始t细胞)、第2天、第4天、第7天、第11天和第13天通过用gf-生物素的岩藻糖基化追踪cd4+t细胞和cd8+t细胞上的lacnac水平。使用酶促gf-igg转移的一般程序用α-he-sel和migg对照标记活化的人t细胞。之后,标记检测和抗原(he-sel-hfc)结合均得到证实。然后将标记的人t细胞在t细胞培养基中以0.5*106个细胞/ml的起始细胞密度培养。标记后24小时跟踪细胞表面migg分子的衰减(抗小鼠igg染色)。在三天内将标记的t细胞与未标记的人t细胞的细胞增殖率进行比较(活细胞计数)。

e-选择素包被载玻片的流动室测定:将无菌载玻片(目录号#12-545m,fisherscientific)用重组人e-选择素-fc(2μg/ml)在室温下包被2小时,然后用酪蛋白封闭至少30分钟。将ibidi黏性玻片i0.1luer(高:150μm,宽:5mm,ibidi)安置在经包被的载玻片上并与入口管和出口管连接。将两组人t细胞混合(用细胞示踪剂绿色染色的未修饰的人t细胞和用细胞示踪剂橙色染色的migg或α-he-sel缀合的人t细胞),然后通过入口管以2x106个细胞/ml的浓度灌注。出口管连接到注射泵(harvardapparatus)。如前所述测定壁剪切应力(abadier等人,2015,coisne等人,2013)。首先使细胞以1dyn/cm2稳定1分钟以在视场(fov)中积累并开始成像获取。然后将剪切应力增强至10dyn/cm2,持续3分钟。为了研究t细胞的行为,用倒置的zeissaxiovert200m(zeiss,feldbach,瑞士)以10x放大率进行图像采集。通过imagej软件(美国国立卫生研究院,bethesda,md)对牢固结合的细胞(剪切应力增加为10dyn/cm2后2分钟期间未移动的)的数量进行定量。

huvec表面上结合的人t细胞的分析:将2000个huvec接种在明胶包被的96孔板的每个孔中并生长至汇合。huvec未经处理或用200u/mltnf-α刺激4小时。使用通用gf-igg转移方案,用migg或α-he-sel标记经cfse染色的人t细胞。用pbs洗涤标记的细胞并在无血清rpmi1640中重悬至106个细胞/ml。在除去huvec的培养基后,将三组(未标记的、migg标记的和α-he-sel标记的)100μlcfse染色的人t细胞(106个细胞/ml)加入未处理组或tnf-α处理组。使细胞在37℃下附着20分钟。除去未结合的人t细胞,并用温热的rpmi轻柔洗涤每个孔两次。使用ripa缓冲液裂解附着的cfse染色的人t细胞。使用平板读数器通过cfse荧光信号(激发492nm/发射517nm)对每个孔中附着的t细胞数进行定量。对于成像分析,huvec在t细胞结合之前被染色(5μg/mldid和2μg/mlhoechst33342在培养基中,37℃持续20分钟)。在加入cfse染色的t细胞之前,用温pbs洗涤huvec三次。结合后,在活细胞成像溶液中补充附着的细胞,并用荧光显微镜成像。

人t细胞的跨膜迁移测定:按照提供的方案,使用白细胞跨膜迁移测定试剂盒进行迁移(transwell)测定。简而言之,将300μlhuvec生长培养基中的50000个huvec细胞添加到底部具有500μl生长培养基的24孔板的插入物中。使细胞生长至汇合并用200u/mltnf-α处理4小时。将106个/ml人t细胞用leukotracker在无血清培养基(含有0.5%bsa、2mmcacl2和2mmmgcl2的rpmi)中于37℃染色1小时,并用无血清培养基洗涤三次。用migg或α-he-sel标记染色的t细胞,并以106个细胞/ml重悬于无血清培养基中。将transwell插入物移至底部含有500μl新鲜t细胞培养基的新孔中,并用300μlt细胞悬浮液替换插入物中的培养基。在37℃孵育4小时后,裂解底部迁移的t细胞,用平板读数器(激发480nm/发射520nm)测量所得荧光信号。

nk-92mi细胞上的igg标记:根据一般方案,用赫赛汀或对照人igg标记nk-92mi细胞或经辐照的nk-92mi细胞(6gy)。标记后,标记检测和抗原(her2-his)结合均得到证实。然后将有或没有igg结合的nk-92mi细胞在t细胞培养基中以0.5*106个细胞/ml的起始细胞密度培养。在第0天、第1天和第2天追踪细胞表面缀合的赫赛汀的衰减(抗人fc染色)。在第0天、第1天、第2天和第3天追踪细胞的增殖率(dapi染色和facs计数)。对于双抗体标记,首先将nk-92mi细胞与gf-α-egfr缀合,然后在洗涤后与gf-赫赛汀缀合。

nk-92mi和bt474之间结合的流动和成像分析:对于流式细胞术分析,用cfse对nk-92mi细胞进行染色,然后根据一般方案用赫赛汀标记或不用赫赛汀标记。首先用did对bt474细胞进行染色,然后以1:1的比例与经赫赛汀标记的或未经赫赛汀标记的nk-92mi细胞混合。两小时后,通过流式细胞术分析细胞混合物。对于荧光成像,将bt474细胞用cfse染色并在玻璃底培养皿中培养过夜。然后用细胞示踪剂橙色对nk-92mi细胞进行染色,然后用赫赛汀或不用赫赛汀标记。将nk-92mi细胞以1:1的比例加入bt474培养物中。两小时后,在pbs洗涤之前和之后通过荧光显微镜对共培养的细胞成像。

nk-92mi细胞介导的针对her2+癌细胞的细胞毒作用的分析:在指定效应物/靶标比例下,将标记的或未标记的nk-92mi细胞与不同类型的癌细胞在96孔板中共培养4小时。在大多数实验中,效应物/靶标比例是5/1。如果指示,则加入游离赫赛汀,最终浓度为5μg/ml。通过上清液中的ldh分泌检测特异性癌细胞裂解(cytotox96,promega)。根据制造商的说明,进行对照组的设置和特异性裂解的计算。还收集每组的上清液并进行颗粒酶belisa试剂盒测试用于定量。

nk-92mi介导的her2+癌症杀伤的小鼠模型:通过尾静脉注射用5*105个mda-mb-435her2+/f-luc细胞接种的30只雌性nsg小鼠(6周龄至8周龄)。一天后,将小鼠随机分成三组(每组10只小鼠)。通过尾静脉注射(每只小鼠3*106个nk细胞)用hbss、nk-92mi或赫赛汀标记的nk-92mi细胞处理每组。在肿瘤攻击后六天,通过腹膜内注射给小鼠注射200μld-萤光素(15mg/ml)。十二分钟后,通过perkinelmerivis系统分析小鼠的生物发光信号。通过ivis软件对指示肿瘤小鼠的总光子进行定量。

原代ot-1cd8+t细胞制备及其表面上的igg标记:将来自ot-1小鼠的脾细胞用1nmova肽在t细胞培养基中活化两天。之后,活化的细胞在含有15ng/mlrhil2或10ng/mlrhil7和20ng/mlrhil15的新鲜t细胞培养基中体外扩增数天(保持8*106个细胞/ml,每两天添加一次含有细胞因子的新鲜培养基)。表征表型(>95%是ot-1cd8+t细胞)。在第0天(初始t细胞)、第2天、第4天、第7天、第11天和第13天通过用gf-生物素的岩藻糖基化追踪ot-1t细胞(用两种不同的细胞因子培养)的lacnac水平。使用酶促gf-igg转移的一般程序用α-pd-l1和migg对照标记活化的ot-1t细胞。之后,标记检测和抗原(pd-l1-hfc)结合均得到证实。然后将标记的ot-1t细胞在t细胞培养基中以0.5*106个细胞/ml的起始细胞密度培养。标记后24小时跟踪细胞表面α-pd-l1分子的衰减(抗大鼠igg染色)。

使用ova脉冲的脾细胞重新刺激ot-1t细胞:用siinfekl(ova)肽(1μg/ml,在t细胞培养基中)脉冲处理来自b6wt小鼠的脾细胞2小时。之后,在使用前将细胞洗涤三次。具有cd45.1同类系标志物的ot-1t细胞用cfse染色,然后用rigg标记。将105个ot-1t细胞(标记的或未标记的)与106个ova脉冲的脾细胞在500μlt细胞培养基中混合。对照组没有脾细胞。将细胞混合物培养3天。之后,用apc抗cd45.1和dapi对细胞进行染色。针对活cd45.1阳性细胞分析cfse稀释信号。

分析ot-1cd8+t细胞介导的对b16-ova的细胞毒作用:将b16-ova细胞(用萤火虫萤光素酶稳定转导)接种于96孔板中,并用10ng/mlifn-γ过夜处理(在这项工作中,用ifn-γ处理所有b16-ova细胞以诱导高表达水平的pd-1)。在指定效应物/靶标比例下,将标记的或未标记的ot-1细胞与b16-ova癌细胞在96孔板中共培养20小时。在大多数实验中,效应物/靶标比例是5/1。在细胞数量化之前对t细胞簇的表型进行成像。根据参考文献,通过萤光素酶活性对b16-ova细胞数进行定量。根据制造商的手册(bright-glo,promega)将检测试剂直接添加到每个孔中的培养基中。对于细胞因子分泌定量,将细胞培养9小时,收集上清液并进行tnf-α和ifn-γelisa试剂盒测定。对于ot-1t细胞在杀伤b16-ova中的增殖,在igg标记之前,通过cfse对ot-1细胞进行染色。将经修饰的细胞与b16-ova细胞以效应物/靶标比例2/1混合。72小时后,将细胞混合物用apc-抗cd8和dapi染色。针对cd8+细胞分析cfse稀释信号。

用于分析ot-1t细胞针对b16肿瘤的体内增殖的竞争测定:将来自ot-1+/-cd45.1+/-和ot-1+/-thy1.1+/-小鼠的脾细胞用1nmova肽活化,通过加入10ng/mlil7和20ng/mlil15进行体外扩增4天。用或不用gf-α-pd-l1和ft处理具有不同同类系标志物的ot-1t细胞。将用α-pd-l1标记的cd45.1+ot-1t细胞与thy1.1+ot-1t细胞以1:1的比例混合。类似地,将未标记的cd45.1+ot-1t细胞与用α-pd-l1标记的thy1.1+ot-1t细胞以1:1的比例混合。通过流式细胞术分析两种不同群体的比例以及α-pd-l1的成功标记。将混合t细胞(10*106个)通过尾静脉注射到携带b16-ova黑素瘤(肿瘤大小:约5mm*5mm)的小鼠中,其中10天前小鼠通过皮下注射在右侧腹接种106个b16-ova细胞。注射t细胞48小时后,收集血液、引流淋巴结(dln)和受体小鼠的肿瘤组织。获得来自每个组织的单细胞,用抗cd3、抗cd8、抗thy1.1、抗cd45.1荧光抗体染色,并通过流式细胞术分析。计算这些组织中thy1.1+/-ot1t细胞和cd45.1+/-ot-1t细胞的比例。

上述各种方法和技术提供了许多实现本发明的方法。当然,应该理解,根据本文描述的任何特定实施方案,无需实现所描述的所有目标或优点。因此,例如,本领域技术人员将认识到,可以以实现或优化本文所教导的一个优点或一组优点的方式执行所述方法,而不必实现本文可能教导或建议的其他目的或优点。本文提到了各种有利和不利的替代方案。应当理解,一些优选实施方案具体包括一个、另一个或几个有利特征,而其他优选实施方案具体地排除一个、另一个或几个不利特征,而另一些优选实施方案通过包含一个、另一个或几个有利的特征明确地减轻当前的不利特征。

此外,技术人员将认识到来自不同实施方案的各种特征的适用性。类似地,本领域普通技术人员可以混合和匹配上面讨论的各种元素、特征和步骤,以及每个这样的元素、特征或步骤的其他已知等同物,以执行根据本文描述的原理的方法。在各种元素、特征和步骤中,在不同的实施方案中将特别包括其中一些,并且特别排除其他元素、特征和步骤。

尽管已经在某些实施方案和实施例的上下文中公开了本发明,但是本领域技术人员将理解,本发明的实施方案超出了具体公开的实施方案,延伸到其他替换实施方案和/或其用途和修改及其等同物。

在本发明的实施方案中已经公开了许多变型和替代元素。更进一步的变型和替代元素对于本领域技术人员来说是显而易见的。在这些变型中,但不限于这些变型,选择本发明组合物的组成模块,以及可以用本发明组合物诊断、预后或治疗的疾病和其他临床病症。本发明的各种实施方案可以具体包括或排除这些变型或元素中的任何一个。

在一些实施方案中,用于描述和要求保护本发明一些实施方案的表示成分、性质的量如浓度、反应条件等的数字应理解为在一些情况下被术语“约”修饰。因此,在一些实施方案中,书面描述和所附权利要求书中列出的数值参数是近似值,其可以根据特定实施方案旨在获得的所需性质而变化。在一些实施方案中,数值参数应根据报告的有效数字的数和通过应用普通的舍入技术来解释。尽管本发明的一些实施方案阐述的宽范围的数值范围和参数是近似值,但尽可能精确地报告了具体实施例中列出的数值。在本发明的一些实施方案中呈现的数值可能包含必然由于在其各自的测试测量中发现的标准差引起的某些误差。

在一些实施方案中,在描述本发明的特定实施方案的背景以及类似的参考文献中(特别是在以下一些权利要求的上下文中)使用的术语“一种”、“一个”和“该”或不使用数量词可以解释为涵盖单数和复数两者。本文中对数值范围的描述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非本文另有说明,否则将各个单独的值并入本说明书中,如同其在本文中单独引用一样。除非本文另有说明或上下文明显矛盾,否则本文所述的所有方法均可以任何合适的顺序进行。关于本文的某些实施方案提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“例如”)的使用仅旨在更好地说明本发明,而不是对要求保护的本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表示对于本发明的实践必不可少的任何未要求保护的要素。

本文公开的本发明的替代元素或实施方案的分组不应解释为限制。每个组成员可以单独地或与该组中的其他成员或本文中找到的其他元素任意组合地提及和要求保护。出于方便和/或可专利性的原因,可以将一个或多于一个组成员包括在组中或从组中删除。当发生任何这样的包含或删除时,本说明书在此被认为包含经修改的组,从而实现所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。

本文描述了本发明的优选实施方案,包括发明人已知的实施本发明的最佳方式。在阅读前面的描述后,那些优选实施方案的变化对于本领域普通技术人员来说将变得显而易见。预期技术人员可以适当地采用这些变化,并且本发明可以以不同于本文具体描述的方式实施。因此,本发明的许多实施方案包括适用法律所允许的所附权利要求中所述主题的所有修改和等同物。此外,除非本文另有说明或上下文明显矛盾,否则本发明涵盖上述元素的所有可能变体的任何组合。

此外,在整个说明书中已经参考了许多专利和印刷出版物。上文引用的每篇参考文献和印刷出版物均通过引用整体并入本文。

最后,应该理解这里公开的本发明的实施方案是对本发明原理的说明。可以进行在本发明的范围内可以采用的其他修改。因此,作为实施例而非限制,可以根据本文的教导利用本发明的替代配置。因此,本发明的实施例不限于精确地如所示和所述的那些。

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