唾液收集、处理、稳定化及储存方法【专利摘要】本文提供一种一体化唾液收集设备,其收集唾液以允许唾液过滤以将唾液成分(如不存在于完整细胞内的胞外蛋白质和核酸)同所提取样品中剩余的完整细胞和残渣分离。可将经过滤的唾液样品等分为两部分,用于蛋白质和/或核酸分析。本发明进一步描述了经过滤的唾液核酸在室温下的长期储存方案,以及添加了乙醇溶液的经过滤的唾液蛋白质在室温下的长期储存方案。经过滤的无细胞唾液样品具有诊断应用性。【专利说明】唾液收集、处理、稳定化及储存方法[0001]相关申请的交叉参考[0002]本申请要求2012年8月4日提交的USSN61/515,169的优先权,其通过引用全文纳入本文。[0003]关于政府权利的声明[0004]本发明在国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的基金号CAO126733的政府资助下完成。政府享有该发明中的某些权利。【技术领域】[0005]本公开涉及用于分析唾液无细胞样品中存在的蛋白质与核酸的设备和方法。【背景技术】[0006]人们对于用唾液作为疾病检测和健康监护的诊断工具的兴趣正与日俱增,原因在于其无创可得性、经济性、易于样本收集和处理,以及越来越多的科学依据(Yan等,Proteomics Clin.Appl.3:116 (2009)山一一和如叩’六!!! J.Dent.22:241-8 (2009))。唾液已用于检测,例如龋病风险、牙周炎、口腔癌、乳腺癌、肺癌、干燥综合征(Sjdgren’s syndrome)、唾液腺疾病和传染性疾病(如肝炎、HIV和HCV)。因此,唾液是替代血液、血清或血浆的一种吸引人的诊断样品。 [0007]唾液对于核酸分析而言是理想的。通过使用微阵列技术,在2004年首次发现了无细胞唾液中的人类唾液转录组(Li等,J.Dent.Res.83:199-203 (2004)) 0随后研究了唾液RNA的特点,使得唾液转录组学的发展成为研究焦点(Park等,Clin.Chem52:988-94 (2006) ;Park 等,Arch.0ral.Biol.,52:30-5 (2007))。[0008]此外,唾液对于蛋白质组学分析而言也是理想的。在疾病进展病程中剖析唾液中的蛋白质能揭示疾病不同阶段指示性的生物标志物,这可用于早期检测和/或医疗诊断(Hu等,Proteomics6:6326 (2006))。蛋白质组学被广泛设想为针对生物标志物发展的独特且有力的方法。随着蛋白质组学技术日臻成熟,蛋白质组学对于唾液蛋白质组学生物标志物的发展和进一步的临床应用而言具有很大潜力(Xiao和Wong,Bioinformations:294 (2011) ;Zhang 等,Mol.Diagn.Ther.13:245 (2009))。[0009]然而,目前从唾液提取核酸和蛋白质的方法要求在收集唾液样品后立即处理,并且需要特殊的仪器和受训人员。例如,目前用于唾液转录组学诊断的标准方法需要进行耗时费力的mRNA分离。此外,过程复杂性的增加使得操作员之间的差异增大。虽然多款市售可得的自动化装置能够提高mRNA的分离效率(如KINGFISHER〈QIACUBE和MAXWELL16),但生产能力仍然受限于每次运行所处理的样品数量。此外,处理RNA时需要特别小心,因为其本身不稳定且RNA酶无处不在。同样地,目前用于唾液蛋白质组学诊断的标准方法需要添加蛋白酶抑制剂以防止蛋白质水解。结果是,目前用于转录组学和蛋白质组学诊断的方法需要向唾液样品添加核酸和蛋白质稳定剂,之后储存于_80°C。[0010]分析唾液以监测健康状况和疾病的能力是口腔健康促进与研究的一个非常希望达到的目标。为全面实现唾液作为生物标志物来源的诊断和研究应用,需要在用户友好的集成型医疗点(point of care)收集系统中由非专业人员收集、处理及室温储存唾液的系统。

【发明内容】

[0011]唾液是理想的转化研究工具和诊断介质,并以独特方式被用于提供针对多种口腔和全身性疾病与病症的分子生物标志物。口腔健康促进和研究非常需要分析唾液以监测健康状况和疾病的能力。唾液已被用于检测龋病风险、牙周炎、口腔癌、乳腺癌、唾液腺疾病和传染性疾病(如肝炎、HIV和HCV)。唾液分析物的检测需要最优化的收集、处理和储存过程与条件。[0012]在一个实施方式中,提供一种使分离自唾液样品的RNA和蛋白质样品稳定的方法。所述方法包括:a)从对象收集唾液样品;b)过滤该唾液样品以形成无细胞的经过滤样品;c)将所述经过滤样品收集在至少第一和第二接收装置中;d)向所述第一接收装置添加醇溶液以形成含醇的经过滤样品,该样品包含蛋白质样品,前提是不向第二接收装置添加醇以形成无醇的经过滤样品,该样品包含核酸样品;其中使所述蛋白质样品和核酸样品在25摄氏度下储存时稳定至少3天;以及e)对所述第一和第二接收装置内收集的经过滤样品进行分析,所述分析包括如下一种或多种:对含醇的经过滤样品的进行蛋白质分析或对无醇的经过滤样品进行核酸分析。在又一个实施方式中,根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式,所述核酸是DNA。在又一个实施方式中,根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式,所述核酸分析是聚合酶链式反应(PCR)。在又一个实施方式中,根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式,所述核酸是RNA。在又一个实施方式中,根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式,所述核酸分析是RT-PCR。在又一个实施方式中,根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式,所述RT-PCR为反转录定量实时PCR(RT-qPCR)。在又一个实施方式中,根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式,所述乙醇溶液包含20%乙醇。在又一个实施方式中,根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式,所述乙醇溶液包含15-25%乙醇。在又一个实施方式中,根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式,所述乙醇溶液包含5-35%乙醇。在又一个实施方式中,根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式,所述蛋白质分析包括western印迹、质谱蛋白质鉴定或ELISA。在又一个实施方式中,根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式,所述经过滤的样本储存于室温下。在又一个实施方式中,根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式,所述经过滤的样品在室温下储存至少两周,其中所述经过滤的样品中存在的蛋白质或核酸的降解不超过50%。在又一个实施方式中,根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式,所述经过滤的样品在室温下储存至少两周,其中所述经过滤的样品中存在的蛋白质或核酸的降解不超过25%。在又一个实施方式中,根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式,所述经过滤的样品在室温下储存至少十周,其中所述经过滤的样品中存在的蛋白质或核酸的降解不超过50%。在又一个实施方式中,根据任何上述事实方式或结合任何上述实施方式,所述经过滤的样品在室温下储存至少十周,其中所述经过滤掉样品中存在的蛋白质或核酸的降解不超过25%。在又一个实施方式中,根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式,所述滤器选自下组:0.22 μ m、0.45 μ m和5.0 μ m亲水膜。在又一个实施方式中,根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式,所述滤器是0.22 μ m亲水膜。[0013]在另一个实施方式中,提供收集唾液样品供生物标志物检测的的装置。在又一个实施方式中,根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式,所述装置包含样本收集垫、滤器、两个或更多个接收装置,其中所述接收装置选自mRNA收集管、多肽收集管和DNA收集管,其中所述多肽收集管包含乙醇溶液,而所述DNA收集管包含DNA稳定剂,其中所述滤器被可操作地连接至所述接收装置。在又一个实施方式中,根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式,所述滤器选自下组:0.22 μ m、0.45 μ m或5.0 μ m亲水膜。在又一个实施方式中,根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式,所述滤器是0.22 μ m亲水膜。在又一个实施方式中,根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式,提供一种使用所述装置的方法。所述方法包括:将样本收集垫插入口腔保持足够时间以使所述样本收集垫润湿,将收集垫插入接收管,施加足够的力使所述收集垫中收集的物质通过滤器,由此形成经过滤的样品,以及将所述经过滤的样品收集入一个或多个接收装置。[0014]在另一个实施方式中,提供一种使分离自唾液样品的RNA和蛋白质样品稳定的方法。所述方法包括:a)收集来自人类对象的唾液样品;b)使用0.22 μ m~5.0 μ m亲水膜过滤所述唾液样品以形成无细胞的经过滤样品;c)将所示经过滤样品收集在第一和第二接收装置中;d)向所述第一接收装置添加乙醇溶液以形成含20%乙醇的经过滤样品,该样品包含蛋白质样品,前提是不向所述第二接收装置添加醇以形成无醇的经过滤样本,该样品包含核酸样品;其中使所述蛋白质样品和核酸样品在25摄氏度下储存时稳定至少3天。在又一个实施方式中,根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式,所述方法还包括如下步骤:(e)对所述第一和第二接收装置内收集的经过滤样品进行分析,所述分析包括如下一种或多种:对含乙醇的经过滤样品进行蛋白质分析或对无醇的经过滤样品进行核酸分析。在又一个实施方式中,根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式,使所述蛋白质样品在25摄氏度下储 存时稳定至少2周。在又一个实施方式中,根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式,使所述核酸样品在25摄氏度下储存时稳定至少10周。在一些实施方式中,所述乙醇溶液包含15-25%乙醇。在又一个实施方式中,根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式,所述乙醇溶液包含5-35%乙醇。在又一个实施方式中,根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式,所述亲水膜是0.22 μ m膜。【专利附图】

【附图说明】[0015]图1显示实施例1的实验设计的示意图。[0016]图2显示使用人细胞基因组DNA (300 μ g/ml)作为模板证明通过所述DNA酶处理法获得的DNA去除效果。实心柱代表GAPDH、白色柱代表ACTB,而条纹柱代表RPS9。[0017]图3显示在第O天通过标准方法和DSTA方法分析的3种SIRG mRNA的表达水平。[0018]图4显示无稳定剂存在时在室温下储存10周期间测量的3种SIRG mRNA的表达水平。[0019]图5采用盒须图显示OSCC唾液转录本验证研究中使用的90个临床样品的Cq值分布。各转录本的结果单独显示:(A) H3F3A ; (B) ILlB ; (C) IL8 ; (D)OAZi ; (E) SATl ; (F)DUSPl以及(G) SlOOP0在第O天和第10周通过标准和流水化的方法在27名OSCC对象和63名正常对象中检测各转录本(仅DSTA法),其在X轴上用I 一 6表示:1:通过标准方法分析的正常对象;2:通过标准方法分析的OSCC对象;3:第O天通过SDTA法分析的正常对象;4:第O天通过DSTA法分析的OSCC对象;5:第10周通过DSTA法分析的正常对象;以及6:第10周使用DSTA法分析的OSCC对象;Y轴表示各图中的原始Cq值。[0020]图6显示(A)各自通过标准方法检测的7个OSCC唾液转录本的ROC曲线,⑶各自在第O天通过DSTA检测的7个OSCC唾液转录本的ROC曲线,以及(C)各自在第10周通过DSTA检测的7个OSCC唾液转录本的ROC曲线。[0021]图7显示实施例2的唾液样品收集和实验设计的示意图。[0022]图8显示唾液β -肌动蛋白的ELISA分析:RT+R:RT +蛋白酶抑制剂;4°C +R:4度+蛋白酶抑制剂(n = 5) (*:ρ

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