【实验原理】一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质(或酶)。因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志,检测蛋白质的方法很多,除 ELISA 法外,也可用与检测 DNA 和 RNA 相类似的吸印方法。前两法有「南"和「北"之意,故本法遂被延伸称为 Western(西)印迹法,该法能用 SDS PAM 凝胶电泳分辨出与专一抗血 清结合的专一性蛋白质。将 PAM 凝胶上分辨出的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上并与第一抗体共孵。第一抗体专一地与待分离蛋自质的抗原决定簇结合,然后用 另一种蛋自质,如 135I-蛋白 A 或辣根过氧化物酶连接的山羊抗 IgG 检测已结合上去的抗体。本法所需时间 6 小时

 

蛋白质的 PAM 凝胶电泳 

 

几乎所有蛋白质电泳分析都在 PAM 凝胶上 进行,而所用条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并尽可能减少其相互间的聚集。最常用的方法是将强阴离子去污剂 SDS 与某一还原剂并用,并通过加热使蛋 白质解离后再加样于电泳凝胶上。变性的多肽与 SDS 结合并因此而带负电荷,由于多肽结合 SDS 的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关,因此 SDS 多肽复合物在 PAM 凝胶电泳中的迁移只与多肽的大小相关。在达到饱和的状态下,每克多肽约可结合 1.4 克去污剂,借助已知分子量的标准参照物,则 可测算出多肽链的分子量。

 

SDS PAM 凝胶电泳大多在不连续缓冲系统中进行,其电泳槽缓冲液的 pH 值与离子强度不同于配胶缓冲液,当两电极间 接通电流后,凝胶中形成移动界面,并带动加入凝胶的样品中所含的 SDS 多肽复合物向前推进。样品通过高度多孔性的积层胶后,复合物在分离胶表面聚集成一条 很薄的区带(或称积层)。曲于不连续缓冲系统具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力,故大大提高了 SDS PAM 凝胶的分辨率。

最广泛 使用的不连续缓冲系统最早是由 Ornsstein(1964)和 Davis(1964)设计的,样品和积层胶中含 Tris-Cl(pH6.8),上下槽缓 冲液含 Tris-甘氨酸(pH8.3),分离胶中含 Tris-Cl(pH8.8)的。系统中所有组分都含有 0.1% 的 SDS(Laemmli, 1970),样品和积层胶中的氯离干形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界,在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域,它推 动样品中的多肽前移并在分离胶前沿积聚,此处 pH 值较高,有利于甘氨酸的离子化,所形成的甘氨酸离子穿过堆集的多肽并紧随氯离子之后,沿分离胶泳动。从移 动界面中解脱后,SDS 多肽复合物成一电位和 pH 值均匀的区带泳动穿过分离胶,并被筛分而依各自的大小得到分离。【常用试剂】1)30%  C3H5NO/0.8% N,N』-C7H10N2O2将 30 克 C3H5NO 和 0.8 克 N,N』-C7H10N2O2 溶于总体积为 60 ml 的水中,加热至 37℃ 溶解之,补加水至终体积为 100 ml。0.45µm 微孔滤膜过滤除菌,查证该溶液 pH 应不大于 7.0,置棕色瓶中保存。小心: C3H5NO 具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收,其作用具有累积性。称量 C3H5NO 和 N,N』-C7H10N2O2 时应戴手套和面具。可认为 PAM 无毒,但也应谨慎操作,因为它还可能含有少量未聚合材料。2)4×Tris?Cl/SDS, pH8.8,在 300 mlH2O 中溶解 91 g Tris 碱(1.5mol/L),用 1mol/L 调节 pH 至 8.8, 补加 H2O 至体积 500 ml。用 0.45um 滤膜过滤溶液,再加入 2 g SDS[0.4%(w/v)],于 4℃ 可保存 1 月。3)4×Tris?Cl/SDS, pH6.8,在 40 mlH2O 中溶解 6.05 g Tris 碱(0.5mol/L),用 1mol/L 调节 pH 至 6.8, 补加 H2O 至体积 100 ml。用 0.45um 滤膜过滤溶液,再加入 0.4 g SDS[0.4%(w/v)],于 4℃ 可保存 1 月。4)4×SDS 电泳缓冲液Tris base    24.2 gGlycerin    115.3 g20%SDS     20 ml加水至总体积 1000 ml。应用时稀释 4 倍即为 1×SDS 电泳缓冲液(Tris 0.05M, Glycerin 0.38M, SDS 0.1%)。5)TEMED(N,N,N』,N』-四甲基 C2H8N2)TEMED 通过催化 (NH4)2S2O8 形成自由基而加速 C3H5NO 和 N,N』-C7H10N2O2 的聚合。6)10% (NH4)2S2O8(NH4)2S2O8 提供驱动 C3H5NO 和亚甲 C3H5NO 聚合所必需的自由基。可用去离子水配制小量 10%(w/v)的贮存液并保存于 4℃。由于 (NH4)2S2O8 会缓慢分解,故应隔周新鲜配制。【操作步骤】1)按厂商的使用指南用两块干净的玻璃,平板和 0.75 mm 垫片组装电泳装置中的玻璃平板夹层,并固定在灌胶支架上。2)按表 1 配制分离胶液体并脱气,然后加入 10% 的 (NH4)2S2O8 和 TEMED,轻轻搅拌混匀。

 

表 1 PAM 分离胶的配制      试剂成分配制不同浓度分离胶所需试剂(ml)                                   5%          8%           10%           12%                15%Acry:Bis (30:0.8)   2.50       4.00           5.00            6.00                7.504×Tris?Cl/SDS, pH    8.8          3.75           3.75            3.75               3.75H2O                          8.75        7.25            6.25           5.25                3.2510% (NH4)2S2O8            0.05        0.05            0.05           0.05                0.05TEMED                     0.01        0.01            0.01            0.01               0.01

 按所需分离的蛋白质分子大小选择合适的 C3H5NO 百分比浓度,一般地,5% 的凝胶可用于 60~200kDa 的 SDS 变性蛋白质分子的分离,10% 用于 16~70kDa,15% 用于 12~45kDa。3)用一根巴斯德吸管立即将分离胶液体沿夹层中一条垫片的边缘加入于玻璃平板夹层中,至凝胶约 5 cm 高为止。样品体积少于 10μl 不需灌制积层胶。4)用另一根已斯德吸管,先从一边的垫片,再从另一边垫片往夹层的液面顶部缓缓加入一层水饱和 C4H10O(厚约 1 cm)。让凝胶在室温聚合 30 min。聚合后,可见在顶层C4H10O与凝胶的界面间有一清晰的折光线,胶的聚合失败往往问题在于过硫酸按或 TEMED,或两者都有。5)倾去顶层的C4H10O,并以 1×Tris-Cl/SDS, pH8.8 缓冲液冲洗凝胶的顶部表面, 尽量用吸水纸吸干。6)按表 2 配制积层胶液体,用吸管将液体沿一条垫片加入到玻璃平板夹层,直至夹层的顶部。       

     表 2 PAM 积层胶的配制GEL%(3.9%)            Total (10.05 ml)Acry:Bis(30:0.8)                     1.30 ml4×Tris?Cl/SDS,                pH6.8 2.50 mlH2O                                            6.10 ml10% (NH4)2S2O8                              0.05 mlTEMED                                       0.01 ml

7)将 0.75 mm 厚的梳子插入夹层的积层胶液体中,必要时,再补加积层胶液体充盈剩余空间。让积层胶室温聚合 30 min。8)在具螺口盖的微量离心管中,用 2×SDS 加样缓冲液按 1:1(v/v)稀释待测蛋白质样品,于 100℃ 煮沸 5-10 min。如样品是蛋白质沉淀物,加入 50~100µl 1×SDS 加样缓冲液溶解之,并同样在 100℃ 煮沸 5-10 min。按供应商的使用指南用 2×SDS 加样缓冲液溶解蛋白质分子量标准混合物。对于 0.3 cm 宽的加样孔,推荐加样体积以不超过 20µl 为宜。用考马斯亮蓝染色法显迹,成分很复杂的蛋白质混合物需加 25~50 µg,而样品中只有一种或不多的几种蛋白的话,只需 1~10 µg 蛋白量。采用银染 显迹时,样品用量可减小 10~100 倍(按样品的复杂程度在小于 20µl 的体积溶有 0.01~0.5ng 蛋白样品不等)。2×SDS 加样缓冲液(loading buffer)配制:成分                                   体积 (ml)0.5M Tris?Cl (pH6.8)        12.520%SDS                                11.5Glycerin                                  102% Blue-Bromo-phenol          2.5β-mercaptoethanol * 5.0加 H2O 至总体积 50 ml,分装*β-mercaptoethanol 在临用前加入。9)小心拔出梳子,避免撕裂 PAM 凝胶加样孔。取出梳子后,以 1×SDS 电泳电泳缓冲液冲洗加祥孔,并以此缓冲液充满之。10)按厂商指南将凝胶板固定到电泳装置的上缓冲液室(上槽),同时往下缓冲液室(下槽)加入推荐量的 1×SDS 电泳缓冲液。11)将固定于上槽的凝胶板放入下槽中,并往上槽加入部分电泳缓冲液至刚好淹没凝胶的加样孔。12)用带平嘴针头的 50µl 注射器将同样浓度的蛋白质样品等体积加入到样品孔中,小心加样使样品在孔的底部成一薄层,对照孔加入蛋白质分子量标准样品,如有空置的加样孔,须加等体积的空白 1×SDS 样品缓冲液,以防相邻泳道样品的扩散。13)再往上槽加入余下的 1×SDS 电泳缓冲液。此操作缓慢小心,以防冲起样品孔中的样品。14)连接电源,对于 0.75 mm 厚的垂直板电泳,先在 60V 下电泳至溴酚蓝染料从积层胶进入分离胶,再将电压调至 120V 继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部为止。15)关闭电源并撤去连接的导线,弃去电泳缓冲液。连同上槽一起将凝胶夹层取出。16)将凝胶定位以便识别加样的顺序,将凝胶板从上槽解离出来,放在一叠吸水纸或纸巾上。17)小心将封边的垫片抽出一半,并以此为杠杆橇起上面的玻璃平板,使凝胶暴露出来。18)小心从下面的玻璃平板上移出凝胶,在凝胶的一角切去一小块以便在染色及干胶后仍能认出加样次序,接着就可进行蛋白质的检测。19)转膜:将凝胶面与负极相连,硝酸纤维素膜与正极相连。(100V,1 小时)要放于 4℃。20)清洗:将硝酸纤维素膜放入 1X TBST 中清洗 3 次,每次 5 分钟。摇床摇动。21)封闭22)一抗孵育:一抗用 TBST1:1000 稀释,将硝酸纤维素膜放入其中,37℃ 孵育 1.5 小时,摇床摇动。23)清洗:将硝酸纤维素膜放入 1X TBST 中清洗 3 次,每次 5 分钟。24)二抗孵育:二抗用 TBST1:8000 稀释,将硝酸纤维素膜放入其中,37℃ 孵育 1 小时,摇床摇动。25)清洗:同 22,之后,用 1X TBS 在清洗 2 次,每次 5 分钟,以洗去膜上的 Tween 20,因为它可以阻碍底物的沉积。26)显色按如下配方配制显色液:1 mL 水+1 滴(大约 50 微升)试剂 A(之后混匀)+1 滴试剂 B+1 滴试剂 C将硝酸纤维素膜放入其中孵育,一旦显色,立即放入去离子水中终止反应。

 

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